biobiobio


 
 

Genotypowanie roślin i grzybów

Standardowe postępowanie podczas izolacji DNA z roślin


Ekstrakcja DNA z tkanek roślinnych może się różnić w zależności od użytego materiału. Zasadniczo wszelkie mechaniczne środki niszczą ścianę komórkową i błony, umożliwiając tym samym dostęp do materiału jądrowego bez jego degradacji. Zazwyczaj w celu zniszczenia ściany komórkowej stosuje się rozcieranie tkanki roślinnej (ok. 200 mg) w moździerzu lub mielenie w homogenizatorze z wykorzystaniem ciekłego azotu, co pozwala na dostanie się do DNA, z jednoczesnym inaktywowaniem enzymów wewnątrzkomórkowych. W momencie, gdy tkanka zostanie dostatecznie zmielona, może zostać zawieszona w odpowiednim buforze. W celu oczyszczenia, cząstki stałe usuwane są przez wirowanie, a rozpuszczalne białka i inne cząsteczki są rozdzielane przez mieszanie z chloroformem i wirowanie. Następnie DNA może być wytrącone z fazy wodnej i dokładnie przemyte, by usunąć zanieczyszczające próbkę sole. Oczyszczone DNA można przechowywać zawieszone w sterylnej wodzie lub buforze TE. Taki sposób postępowania, okazał się dawać nienaruszone genomowe DNA z tkanek roślinnych, przez co właśnie ta procedura jest dość znana i często wykorzystywana podczas izolacji DNA z materiału roślinnego w tym również w naszym Laboratorium BioTe21.


Modyfikacje standardowych metod izolacji DNA


W 1984 roku, Saghai-Maroof i wsp., opracowali szybką i stosunkowo niedrogą metodę izolacji DNA z materiału roślinnego, która stała się alternatywą do ówcześnie wykorzystywanej długiej, drogiej i mało wydajnej procedury izolacji z liści soi. W przedstawionej metodzie stosowano bromek heksadecylotrimetyloamonu (CTAB) i liofilizowane tkanki. Procedura ta cieszyła się sporym powodzeniem, do czasu gdy J. A. Doyle i J. L. Doyle w 1987 roku wprowadzili do niej pewne modyfikacje. Wtedy to ich ulepszona metoda została uznana za skuteczną w izolacji kwasów nukleinowych ze świeżych liści, a także w odniesieniu do suszonej masy liściowej, dzięki czemu stała się powszechnie stosowaną metodą izolacji roślinnego DNA.

W modyfikacji Doyle’a 1mg tkanki (liść) i miele się w moździerzu z gorącym buforem CTAB. W trakcie izolacji do próbki dodaje się jedną objętość alkoholu izoamylowego, a na koniec próbkę ekstrahuje się jedną porcją izopropanolu. Ta uproszczona metoda pozwoliła na zmniejszenie potencjalnego zanieczyszczenia krzyżowego DNA, ponieważ izolacja wymaga tylko jednego transferu DNA.

Stewart C.N i wsp. (1993), zastosowali zmodyfikowaną metodę Doyle’a , uzyskując w trakcie izolacji wydajność DNA równą ok. 150 do 360 ng/g tkanki roślinnej.

Wiele powszechnie wykorzystywanych technik izolacji DNA w biologii molekularnej roślin, opiera się na użyciu do ekstrakcji buforu CTAB w połączeniu z homogenizacją tkanki w moździerzu. Pomimo, iż procedury te są proste wymagają użycia bardzo dużych ilości buforu (ok. 10 ml), zaś stosowane homogenizatory są wielokrotnego użytku, przez co wzrasta ryzyko krzyżowych zanieczyszczeń izolowanej próbki. Sytuacja taka jest niedopuszczalna, ze względu na pojawienie się w następstwie niespecyficznych produktów w reakcji PCR. Ostatnio opracowane metody ekstrakcji DNA mają na celu uniknięcie potencjalnej kontaminacji podczas izolacji.


ITStest kit


Stosowany w naszym Laboratorium BioTe21 kit (ITStest kit) umożliwi identyfikację genetyczną każdego rodzaju roślin i grzybów, która jest coraz szerzej wykorzystywana w różnych gałęziach nauki, od medycyny po przemysł.

Opracowana przez nas technologia identyfikacji jest szybka i tania, a co najważniejsze daje powtarzalne wyniki. Specjalnie zaprojektowana reakcja PCR jest bardzo czuła, dzięki czemu możliwa jest identyfikacja gatunków na podstawie nawet mocno zdegradowanego materiału DNA.

Specjalnie zaprojektowane i zoptymalizowane startery do technologii ITStest , umożliwiają szybką i czułą identyfikację ITS1 i ITS2 (ang. Internal Transcribed Spacer) występujących w rybosomalnym DNA (rDNA). Rejony te są wysoce konserwatywne wśród gatunków. Tak więc, możliwa jest identyfikacja wszelkich gatunków i podgatunków, takich jak: Cleome hassleriana - fenotypowo bardzo podobnej do Cannabis sativa (marihuana), Metasequoia glyptostroboides, Delonis regia, Euterpe oleracea, drzew owocowych, nasion oraz roślin wykorzystywanych w przemyśle. Ponadto, zestaw pozwala identyfikować grzyby, zarówno te wykorzystywane w przemyśle spożywczym, farmakologicznym, jak i grzyby chorobotwórcze.


Jądrowy region DNA – ITS1 i ITS2


Geny rybosomalnego RNA (rRNA) należą do klasycznej rodziny genowej, której członkowie mają identyczną lub prawie identyczną sekwencję. W genomie roślin i grzybów występuje wiele powtórzeń jednostki zawierającej geny rybosomalnego RNA: 18S, 5,8S i 28S oraz wewnętrzne sekwencje transkrybowane tj.: ITS1 i ITS2. Geny kodujące rybosomalne RNA występują w powtórzeniach tandemowych będących w tysiącach egzemplarzy. Na podstawie analizy regionów ITS1 oraz ITS2 (genetycznych markerów) możliwe jest rozróżnienie podobnych do siebie morfologicznie gatunków. Analiza sekwencyjna polimorficznych niekodujących regionów jądrowego DNA (ITS1 i ITS2), jest z powodzeniem stosowana do badań taksonomicznych zwierząt, roślin i grzybów.


Wykorzystanie genotypowania roślin w kryminalistyce


Najnowsze osiągnięcia w dziedzinie badań DNA mają bezpośredni wpływ na wiele dyscyplin nauk przyrodniczych. Wśród wielu zastosowań genetyki molekularnej, wykorzystanie jej w toksykologii sądowej do określania gatunków i geograficznego pochodzenia nielegalnych roślin, wydaje się być jednym z najbardziej obiecujących nurtów nauki opartej na identyfikacji roślin. Możliwości zastosowania technik biologii molekularnej w toksykologii są coraz szerzej zauważane, co w konsekwencji dało początek osobnej dyscyplinie naukowej znanej jako toksykologia molekularna lub toksygenetyka.

Analiza polimorfizmu DNA jest obecnie bardzo powszechnie stosowana również w naszym Laboratorium BioTe21 w celu identyfikacji zarówno zwierząt jak i roślin. Materiał roślinny zbierany przez policję dostarczany jest do laboratoriów toksykologicznych i kryminalistycznych w celu określenia gatunków i ustalenia, czy zawiera on substancje odurzające. W większości przypadków materiał ten jest rozdrobniony i wysuszony, co sprawia, że w praktyce nie można ustalić gatunku roślin lub grzybów według klasycznego podejścia botanicznego na podstawie mikroskopowej oceny morfologicznej. Co więcej, analiza mikroskopowa przeprowadzona np. dla roślin konopi (opierająca się na obserwacji struktur charakterystycznych dla konopi takich jak: gruczoły włosków - włoski, czy obecność związków szczawianu wapnia) nie mogą być wystarczająco wiarygodne. Cechy te brane pod uwagę w trakcie mikroskopowej identyfikacji konopi, ujawniły obecność więcej niż 80 różnych gatunków tych roślin. W takim przypadku, kryminolodzy ratują się analizą chromatograficzną, umożliwiającą wykrycie substancji czynnej, typowej dla danej rośliny. Niestety i ta metoda nie sprawdza się we wszystkich przypadkach, ponieważ posiadanie zbyt małej ilości dostarczonej próbki powoduje, że analiza chromatograficzna staje się bardzo trudna lub wręcz niemożliwa do wykonania. Trudności analityczne w identyfikacji wynikają także z faktu, że wiele związków chemicznych, w tym obecne w konopiach THC (tetrahydrocannabinol), są wrażliwe na czynniki chemiczne i fizyczne, a tym samym łatwo ulegają degradacji. W związku z tym, najlepsza metoda identyfikacji opiera się na wykorzystaniu metod genetycznych, które dają jednoznaczne i pewne wyniki. Dodatkowo izolacja DNA może być przeprowadzona z małej ilości materiału roślinnego obecnego np. w kieszeniach handlarzy narkotyków, bądź znajdującego się na obiektach lub banknotach używanych przez osoby, które mają kontakt z lekami pochodzenia roślinnego. Konopie są roślinami charakteryzującymi się dużą zmiennością, dzięki czemu na podstawie tej zmienności możliwe jest określenie geograficznego pochodzenia okazów Cannabis zebranych przez policję.

Jagadish i wsp. wykazali, że dzięki badaniom genetycznym możliwe jest nie tylko odróżnienie od siebie gatunków badanych roślin, ale także porównanie gatunków Cannabis sativa zbieranych z różnych plantacji (populacje) ujawniające różne sekwencje DNA. Gillan i wsp. przeprowadzili identyfikację Cannabis sativa za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) oraz metodami genetycznymi. W rezultacie, okazało się, że metody genetyczne dają bardziej wiarygodne wyniki i możliwość rozróżniania poszczególnych okazów, czego nie da się określić wykonując analizę HPLC. Genetyczna analiza DNA może być stosowana do identyfikacji praktycznie wszystkich organizmów. Lee i wsp. udowodnili, że ma ona bardzo skuteczne zastosowanie do identyfikacji nie tylko Cannabis sativa, ale i do identyfikacji halucynogennych grzybów z rodziny Panaeolus i Psilocybe.


Identyfikacja grzybów


Genom grzybów zawiera region kodujący podjednostki rybosomów, który nazywany jest rybosomalnym DNA (rDNA). W obrębie rDNA wyróżnia się region niekodujący tj. IGS (ang. intergenic spacer region). Region IGS zawiera fragmenty ETS1 i ETS2 (ang. external transcribed spacer), regiony kodujące elementy strukturalne rybosomu tj.: 18S, 5,8S, 28S oraz wewnętrzne regiony niekodujące określane mianem ITS1 i ITS2 (ang. internal transcribed spacer). W analizie grzybów największe znaczenie mają fragmenty ITS, które charakteryzują się dużą zmiennością międzygatunkową. Fragmenty te wykorzystywane są nie tylko w klasyfikacji taksonomicznej grzybów, ale mogą być też z powodzeniem wykorzystane jako markery molekularne w identyfikacji rodzajowej i gatunkowej.

Standardową metodą identyfikacji gatunkowej grzybów jest analiza morfologiczna, na którą składają się obserwacje makro- i mikroskopowe. Analiza makroskopowa polega na określeniu kilku parametrów tj.: koloru, rozmiaru i charakterystycznych struktur grzybów. Długotrwała i pracochłonna obserwacja mikroskopowa opiera się głównie na porównywaniu wyglądu zarodników, co nie zawsze daje zadowalające rezultaty. Szczególne trudności w analizie napotyka się w przypadkach, które bezpośrednio dotyczą zatruć grzybami, ponieważ zabezpieczone resztki pokarmu oraz popłuczyny z treści żołądka, to materiał często bardzo silnie zdegradowany, w związku z czym nawet doświadczony mikolog może napotkać problemy z analizą morfologiczną dostarczonych w takiej postaci próbek. Tak samo obserwacje mikroskopowe sproszkowanych elementów grzybów halucynogennych sprawiają wiele problemów. Co ciekawe, zdarza się, że cechy morfologiczne (szczególnie zarodniki) są podobne u grzybów należących do gatunków trujących, jak i do tych, które są nietoksyczne. W preparacie mikroskopowym, zarodniki dobrze znanego muchomora sromotnikowego (Amanita phalloides) mogą zostać pomylone z kroplami tłuszczu, które licznie występują w treści pokarmowej. Trudności identyfikacyjne mogą sprawiać także zarodniki gatunków blisko spokrewnionych, m.in. muchomora sromotnikowego jadowitego czy wiosennego.

Identyfikacja roślin i grzybów jest coraz szerzej stosowana. Wiąże się to zarówno z nielegalnym handlem i rozpowszechnianiem zakazanych gatunków roślin (w tym zawierających substancje narkotyczne), jak i z identyfikacją gatunkową roślin zabezpieczonych na miejscu przestępstwa. Aktualnie pojawia się coraz więcej przypadków kiedy wymaga jest identyfikacja genetyczna roślin, a szczególnie, gdy dane rośliny zajmują charakterystyczne nisze ekologiczne.


Rozważając wyżej opisane przykłady, mamy jednoznaczne potwierdzenie, że wykorzystywana w naszym Laboratorium BioTe21 metoda identyfikacji roślin i grzybów jest innowacyjna i niezwykle przydatna. Co więcej, pozwala wyeliminować przeszkody identyfikacji danego gatunku związane ze zbyt małą porcją próbki do analizy, ponieważ dzięki naszemu kitowi ITStest skutecznie wyeliminowaliśmy ten problem. Przeprowadzana przez nas analiza genetyczna umożliwia pozyskanie informacji niemożliwych do uzyskania za pomocą standardowych metod biochemicznych, bądź kiedy zawodzi nawet tak znana metoda jak HPLC.


Przykłady wykorzystania analizy ITS1 i ITS2:


- analiza sekwencji regionów ITS1 i ITS2 nrDNA (Nuclear ribosomal DNA) ma zastosowanie do identyfikacji gatunkowej grzybów trujących i halucynogennych dla celów sądowych,
- identyfikacja grzybów wykorzystywanych w przemyśle spożywczym i farmakologicznym,
- identyfikacja grzybów chorobotwórczych (wywołujących objawy patologiczne) - zastosowanie w medycynie i kryminalistyce,
- identyfikacja genetyczna gatunków wykorzystywana w botanice,
- identyfikacja ras geograficznych,
- systematyka molekularna na poziomie gatunku,
- bezpieczeństwo żywności pochodzącej z nowoczesnej biotechnologii,
- wykrywanie patogenów grzybowych w żywności (np. w uprawie, koncentraty spożywcze), oraz patogenów roślin ( wykorzystanie w rolnictwie),
- kontrola jakości w przemyśle spożywczym.


opracowała: mgr Lidia Koperwas


Literatura:
1) Armbruster G.F.J., Korte A. 2006. Genomic nucleotide variation in the ITS1 rDNA spacer of landsnails. J. Molluscan Studies 72: 211–219.
2) Kallersjo M., Von Proschwitz T., Lundberg S., Eldenas P., Erseus C. 2005. Evaluation of ITS rDNA as a complement to mitochondrial gene sequences for phylogenetic studies in freshwater mussels: an example using Unionidae from north-western Europe. Zool. Scripta 34: 415–424
3) Kałuski T., Soroka M., Kozłowski J., 2011. ZMIENNOŚĆ TRZECH EUROPEJSKICH GATUNKÓW ŚLIMAKÓW Z RODZAJU ARION W ŚWIETLE BADAŃ MOLEKULARNYCH. Progress in Plant Protection/Postępy w Ochronie Roślin 51 (3) 2011
4) Piotrowski P., Grzybowski T., Śliwka K.. THE POSSIBILITIES OF APPLYING MOLECULAR BIOLOGY TECHNIQUES TO FORENSIC TOXICOLOGY
5) Zuber A, Kowalczyk M, Sekuła A , Mleczko P, Kupiec T,2011. Methods used in species identification of hallucinogenic and other poisonous mushrooms in forensic investigations. Problems of Forensic Sciences 2011, vol. LXXXVI, 151–161
6) Doyle J.A., Doyle J.L., 1987. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin (1987) Volume: 19, Issue: 1, Pages: 11-15
7) Doyle, J.J., Dickson E.E., 1987. Preservation of plant samples for DNA restriction endonuclease analysis. Taxon 36: 715-722.
8) Doyle, J.J., Doyle J.L., 1990. A rapid total DNA preparation procedure for fresh plant tissue. Focus 12: 13-15.
9) Doyle, J.J.,1991. DNA protocol for plants. Pp. 283-293 in: Hewitt G, Johnson A.W.B., Young J.P.W., Molecular techniques in Taxonomy. NATO ASI Series H, Cell BiologyVol.57.
10) Stewart C.N.,Jr., Via L.E., 1993. A Rapid CTAB DNA Isolation Technique Useful for RAPD Fingerprinting and Other PCR Applications. BioTechniques 1993 article Vol. 14(5):748-749
11)http://www.cilr.uq.edu.au/UserImages/File/Plant%20Genomic%20DNA%20Extraction%20by%20CTAB%20_2__Fiona.pdf
12) Schoch C.L., Seifert K.A., Huhndorf S., Robert V., Spouge J.L., Levesque C.A., Chen W., and Fungal Barcoding Consortium. Nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region as a universal DNA barcode marker for Fungi.
13) Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America PNAS. Vol 109, no 16. Conrad L. Schoch, 6241–6246
14) Mecler I., Nawrot U., 2008. Metody molekularne stosowane w identyfikacji grzybów z rodzaju Candida. Mikologia Lekarska 2008, 15 (2): 99-103

Komentarze

Widok Uszereguj
Tylko zarejestrowani mogą dodawać komentarze. Zarejestruj się/Zaloguj

Podręcznik biotechnologii

Reklama

Menu podręczne

Kto jest online

121 anonymous users oraz 0 registered users online.

Jesteś niezarejestrowanym lub niezalogowanym użytkownikiem.


 
 
 
Partnerzy:

laboratoria.net Nauka w Polsce Academio Fundacja NanoNet BioCen - BioCentrum Edukacji Naukowej Notatek.pl cebioforum.com materialyinzynierskie.pl Wspieram.to - POLSKI KICKSTARTER - Polska platforma finansowania społecznoœciowego.Tu zrealizujš się Twoje pomysły.

Portal: Redakcja . Współpraca . Kontakt . Polecamy



Wszystkie prawa zastrzeżone 2006-2013 e-biotechnologia.pl
stat4u